以人參多重利用之角度：建立優化發酵製程以開發人參枝葉做為神經保護功效之發酵產品

科技部補助產學合作研究計畫成果精簡報告

以人參多重利用之角度：建立優化發酵製程以開發人參枝葉做為神經保護功效之發酵產品

計畫類別：開發型

計畫編號：MOST－104－2622－B－039－005－CC2

MOST－105－2622－B－039－003－CC2

執行期間：104 年 11 月 1 日至 106 年 10 月 31 日

執行單位：中國醫藥大學

計畫主持人：吳啟瑞

共同主持人：林文鑫

計畫參與人員：藍士豪、藍婉禎、葉恩瑄、趙子緯

處理方式：公開方式：立即公開

 

下載科研報告

 

中文摘要：

本研究初期在測試菌種對皂苷轉化的過程中黑霉菌種對其轉化皆不佳，而乳酸菌 Lactobacillus paralimentarius Manes-Lazaro etal (BCRC80217)，和乳酸菌 Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii Weiss et al. (BCRC12195) 跟益生性乳酸桿菌(CMU995) 這3株菌種中 BCRC80217 優於其餘兩株菌株。而在之後以BCRC80217 對人參粉及人參葉的長時間發酵轉化中，人參粉的生成效果會隨時間增高。而後在第二年研究中另選用 3 種菌株進行人參粉發酵及人參皂苷轉化，發現該 3 種菌株均可將 Rb1 轉化為Rh1、Rh2、F2、CK，其中以代號 3 之菌株具有較高之轉化率；在小型量產之實驗中，代號 3 之菌株可使 CK 及 Rh2 之含量增加約 2倍，而 F2 之含量則可增加近 10 倍。本研究首先探討 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 對抑制 AChE 及 BACE 活性、Abeta 1-40 聚集暨對 Abeta1-40、6-OHDA 及 MPTP 誘導神經損傷之保護作用。結果顯示，Rh1、F2、CK 具較佳之 AChE及 BACE 抑制活性；而在抑制 Abeta1-40 聚集作用上，則以 Rh1、Rh2、F2、CK 較 Rb1、Rb2、Re、Rg1為佳，其中又以 F2、CK 之效果最佳。至於，在對 Abeta 1-40、6-OHDA 及 MPTP 誘導神經損傷之保護作用上，則以 Rh1、Rh2、F2、CK 較 Rb1、Rb2、Re、Rg1 為佳，其中又以 Rh2、CK 之效果最佳。再進一步針對人參萃取液及人參發酵液之活性比較上，兩者均具抑制 AChE 及 BACE 活性、抑制 Abeta 1-40聚集之作用及減少 Abeta1-40、6-OHDA 及 MPTP 造成細胞存活率下降現象，其中均以人參發酵液之活性較佳。本研究繼續比較對擬巴金森氏動物模式及擬阿茲海默氏症動物模式之保護作用。結果發現人參粉與人參發酵品對腹腔注射 MPTP 誘導擬巴金森氏動物模式運動暨平衡能力障礙及腦室注射 Abeta 1-42 誘導擬阿茲海默氏症動物模式空間操作暨參考記憶障礙均具改善之作用，其中又以人參發酵液之效果最佳。總結上述成果，本計畫已獲致 2 株發酵菌可將 Rb1 及 Rg 轉化成較具活性的 Rh1、Rh2、CK、F2，其中代號 3 之人參發酵品較人蔘粉更具改善巴金森氏症運動能力暨平衡能力障礙與阿茲海默氏症空間操作及參考記憶能力下降之藥理活性，應為一個極具開發潛力之產品。

中文關鍵詞： 人參、發酵、ginsenosides、AChE、BACE、Abeta 1-40aggregation、MPTP、amyloid beta peptide、神經保護、巴金森氏症、阿茲海默氏症

 

英文摘要：

In the process of testing for bacteria, ginsenoside transformed bacteria are transformed its poor. Lactobacillus paralimentarius Manes-Lazaro et al (BCRC80217)、Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii Weiss et al . (BCRC12195) and Lactobacillus plantarum (CMU995). In test, BCRC80217 was better than the rest of the two strains. And after a long time to fermentative conversion on BCRC80217 ginseng powder and ginseng leaf, the resulting effect will increase over time. We further selected three fermented bacteria (Code 3, 16 and 60) were used to fermented ginseng and transformed saponin glycosides to saponin aglycones. We found that these three fermented bacteria could transformed Rb1 to Rh1, Rh2, F2 and CK, and code 3 was better than other two fermented bacteria (code 16 and 60). In small fermenter, we also found the contents of CK and Rh2 in fermented ginseng were about twice higher than the contents in ginseng after fermentation, and the content of F2 in fermented ginseng were about ten times higher than the contents in ginseng after fermentation. In first year experiment, we first evaluated the effects of ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) on AChE and BACE activities, Abeta 1-40 aggregation and neurotoxins (including Abeta 1-40, 6-OHDA and MPTP)-induced neuronal damage in vitro. This result indicated that the inhibitory effects of Rh1, F2 and CK on AChE and BACE activities are better than other ginsenosides. Rh1, Rh2, F2 and CK also had potential inhibitory effects on Abeta 1-40 aggregation compared to other ginsenosides such as Rb1, Rb2, Re and Rg1, and F2 and CK are best. In neuroprotective effects, Rh1, Rh2, F2 and CK had better neuroprotective effects against Abeta 1-40, 6-OHDA and MPTP than other ginsenosides such as Rb1, Rb2, Re and Rg1, and Rh2 and CK are best. Furthermore, we compared the effects of ginseng extract and ginseng fermentation extract on AChE activities, Abeta 1-40 aggregation and neurotoxins (including Abeta 1-40, 6-OHDA and MPTP)-induced neuronal damage in vitro. Ginseng fermentation extract had better benefit effects than ginseng extract on AChE and BACE inhibition, the inhibition of Abeta 1-40 aggregation and the neuroprotection of neurotoxins (including Abeta 1-40, 6-OHDA and MPTP)-induced neuronal damage.

In second year experiment, we compared the effects of ginseng powder and fermented ginseng powder on PD-like mice model and AD-like rat model in vivo. This result indicated that ginseng powder and fermented ginseng powder improved the motor dysfunction caused by MPTP in mice (PD-like model) and memory dysfunction caused by intracisternally injection with Abeta 1-42 in rat (AD-like model). Then, the ameliorating effects of fermented ginseng powder on PD-like mice model and AD-like rat model are better than those of ginseng powder. In conclusion, we obtain two fermented bacteria which possessed the better transformed effects on the transformation of Rb1 and Rg to Rh1, Rh2, CK and F2 in this plan. The fermented ginseng powder obtained from code 3 possessed the better improving effects than ginseng powder on PD-like mice model and AD-like rat model. Then, this fermented ginseng powder might be a potential health food and product against PD and AD.

英文關鍵詞： Panax ginseng，Fermentation，AChE，BACE，Abeta 1-40 aggregation，MPTP，amyloid beta peptide，neuroprotection，Parkinson’s disease，Alzheimer’s disease

 

研究摘要：

本研究篩選與分離具有轉化各種型態人參皂苷的酵素,並以HPLC 進行皂苷成分之分析以確認其轉化率，以 BCRC80217 對人參粉及人參葉的長時間發酵轉化中，人參粉的生成效果會隨時間增高在最後 96 小時其轉化率達 27.9%。再進一步針對人參萃取液及人參發酵液之活性比較上，兩者均具抑制 AChE 活性、抑制 Abeta 1-40 聚集之作用及減少 Abeta 1-40、6-OHDA 及 MPTP 造成細胞存活率下降現象，其中均以人參發酵液之活性較佳。本研究繼續比較人參粉與人參發酵品對擬巴金森氏動物模式及擬阿茲海默氏症動物模式之保護作用。結果發現人參粉與人參發酵品對腹腔注射 MPTP 誘導擬巴金森氏動物模式運動暨平衡能力障礙及腦室注射 Abeta 1-42 誘導擬阿茲海默氏症動物模式空間操作暨參考記憶障礙均具改善之作用，其中又以人參發酵液之效果最佳。總結上述成果，本計畫已獲致 2 株發酵菌可將 Rb1及 Rg 轉化成較具活性的 Rh1、Rh2、CK、F2，其中代號 3 之人參發酵品較人蔘粉更具改善巴金森氏症運動能力暨平衡能力障礙與阿茲海默氏症空間操作及參考記憶能力下降之藥理活性，應為一個極具開發潛力之產品。

 

人才培育成果說明：

本研究共培育三名碩士級專任助理及一名碩士生

 

技術研發成果說明：

進行各類 ginsenosides (Rb1, Rb2, Re, Rg1, Rh1, Rh2, F2,

CK) 等之活性比較, 發現 Rh1, Rh2, F2, CK 之上述藥理活性評估明顯優於其他 ginsenosides (Rb1, Rb2, Re,II Rg1) ，已產出2 株發酵菌可將 Rb1 及 Rg 轉化成較具活性的 Rh1、Rh2、CK、F2，其對 AChE 及 Abeta 1-40 聚集現象之抑制活性均明顯優於人參萃取物，其中代號 3 之人參發酵品較人蔘粉更具改善巴金森氏症運動能力暨平衡能力障礙與阿茲海默氏症空間操作及參考記憶能力下降之藥理活性，應為一個極具開發潛力之產品。

技術特點說明：選用 BCRC80217 菌種及批號 3 菌種可將 Rb1 轉化成 Rh1、Rh2、CK、F2

可利用之產業及可開發之產品：含 Rh1、Rh2、CK、F2 之人參發酵品推廣及運用的價值：含高效價 Rh1、Rh2、CK、F2 成分之人參發酵品

 

摘要

人參皂苷（ginsenoside）是從人參中提取出來的萜類化合物，是人參諸多藥理作用（抗失智及抗癌）的主要活性成分，然而，人參皂苷口服後難以被直接吸收，必須經過腸內菌的去醣基化後才能啟動其藥理活性，因此，人參皂苷的去醣基化過程對其藥理活性表現是一個重要關鍵。但是，人體腸道細菌的種類在個體之間差異很大，因此在不同個體間無法發揮一致的藥效。基於此，本研究試圖開發出一種人參發酵產品，其內容物為含有較高活性的人參皂苷元，此產品除了提高人體口服人參產品後之吸收率及有效性，更因其具有廣闊的市場潛力而可促進中醫藥生技產業在台灣之經濟發展。

本研究初期將黑霉菌及各種菌屬的乳酸菌菌株,進行篩選與分離具有轉化各種型態人參皂苷的酵素，並以 HPLC 進行皂苷成分之分析以確認其轉化率，在測試菌種對皂苷轉化的過程中黑霉菌種對其轉化皆不佳，而乳酸菌 Lactobacillus paralimentarius Manes-Lazaro et al (BCRC80217)，和乳酸菌 Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Weiss et al. (BCRC12195) 跟益生性乳酸桿菌 (CMU995) 這3株菌種中 BCRC80217 優於其餘兩株菌株。而在之後以BCRC80217 對人參粉及人參葉的長時間發酵轉化中，人參粉的生成效果會隨時間增高，而人參葉發酵則因人參葉中可能含有的抑制物影響，導致轉化效果不佳。而後在第二年研究中另選用 3 種菌株進行人參粉發酵及人參皂苷轉化，發現該 3 種菌株均可將 Rb1 轉化為Rh1、Rh2、F2、CK，其中以代號 3 之菌株具有較高之轉化率；在小型量產之實驗中，代號 3 之菌株可使 CK 及 Rh2 之含量增加約 2 倍，而 F2 之含量則可增加近 10 倍。

本研究首先探討 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 對抑制 AChE及 BACE 活性、Abeta 1-40 聚集暨對 Abeta 1-40、6-OHDA 及 MPTP 誘導神經損傷之保護作用。結果顯示，Rh1、F2、CK 具較佳之 AChE及 BACE 抑制活性；而在抑制 Abeta 1-40聚集作用上，則以 Rh1、Rh2、F2、CK 較 Rb1、Rb2、Re、Rg1 為佳，其中又以 F2、CK之效果最佳。至於，在對 Abeta 1-40、6-OHDA 及 MPTP 誘導神經損傷之保護作用上，則以 Rh1、Rh2、F2、CK 較 Rb1、Rb2、Re、Rg1 為佳，其中又以 Rh2、CK 之效果最佳。再進一步針對人參萃取液及人參發酵液之活性比較上，兩者均具抑制 AChE 及 BACE 活性、抑制 Abeta 1-40聚集之作用及減少 Abeta 1-40、6-OHDA 及 MPTP 造成細胞存活率下降現象，其中均以人參發酵液之活性較佳。

本研究繼續比較人參粉與人參發酵品對擬巴金森氏動物模式及擬阿茲海默氏症動物模式之保護作用。結果發現人參粉與人參發酵品對腹腔注射 MPTP 誘導擬巴金森氏動物模式運動暨平衡能力障礙及腦室注射 Abeta 1-42 誘導擬阿茲海默氏症動物模式空間操作暨參考記憶障礙均具改善之作用，其中又以人參發酵液之效果最佳。

總結上述成果，本計畫已獲致 2 株發酵菌可將 Rb1 及 Rg 轉化成較具活性的 Rh1、Rh2、CK、F2，其中代號 3 之人參發酵品較人蔘粉更具改善巴金森氏症運動能力暨平衡能力障礙與阿茲海默氏症空間操作及參考記憶能力下降之藥理活性，應為一個極具開發潛力之產品。

關鍵詞：人參、發酵、ginsenosides、AChE、BACE、Abeta 1-40 aggregation、MPTP、amyloid beta peptide、神經保護、巴金森氏症、阿茲海默氏症

 

前言

人參之主要化學成分為人參皂苷（gisenosides），目前植物化學家已自人參中發現 150 種以上之人參皂苷；按結構大致可分成兩大類：dammarane-type gisenosides 及 oleanane-type gisenosides，而dammarane-type gisenosides 又可再分成兩種類型：protopanaxadiol-type gisenosides、protopanaxatriol-type gisenosides。其中，protopanaxadiol-type gisenosides 以 Rb1、Rb2、Rd、Rh2、F2 等為主，在藥典規範中 Rb1 含量不得少於 0.2%；而protopanaxatriol-type gisenosides 則以 Re、Rg1、Rg2、Rh1、F1 等為主，在藥典規範中 Re 及 Rg1 含量不得少於 0.3%。至於，oleanane-type gisenosides 則以 Ro 為主，但含量甚低，因 oleanane-type gisenosides 之含量甚低，故甚少被認為係人參之活性成分；因此上均認為 dammarane-type gisenosides 為人參之主要活性成分，現階段針對 dammarane-type gisenosides (主要以Rb1、Re、Rg1 等含量較高之成分) 之研究發現其藥理活性與上述人參之藥理活性相同，諸如改善記憶、抗疲勞、抗衰老、降血糖、保護心血管功能、提高免疫力、抗腫瘤、保肝…等，也因此在上述市場行銷販售之保健食品或腫瘤治療輔助食品均強調其產品人參總皂苷之含量。而再進一步以抗癌活性為標的，所進行結構藥效關係之探討研究中，認為 dammarane-type gisenosides 之抗癌活性主要與糖基的數量呈反比關係，當結構中完全不代糖基(苷元，aglycone)或僅於C3 或C20 中帶一個糖基具有較佳之活性；也因此現今市場上寄望開發出高含量之 Rh1 或 Rh2 產品以獲取較好之效價與較高之利潤。至於，改善記憶障礙及抗失智藥理活性部分，現階段亦認為其結構藥效之關係應與抗癌活性相似，因此建議以開發出高含量之 Compound K(M1)或完全不代糖基之苷元產品；而現在之藥理研究亦證實Compound K 或 Rh1 均具有改善記憶障礙及神經保護之作用，且其效價均較 Rb1 或 Rg1 為佳。如前所述人參主要成分為 dammarane-type ginsenosides，而 dammarane-type ginsenosides 於體內主要活性代謝物為Rh1、F1、Rh2、F2、compound K，甚或為protopanaxadiol-type aglycone 或protopanaxatriol-type aglycone。但因個體腸道菌落之差異度甚大，將影響 dammarane-type ginsenosides 之轉化率，進而影響其吸收，造就個體藥效上之差異；因此已有很多研究者擬從不同方式從事Rh1、F1、Rh2、F2、compound K，甚或為protopanaxadiol-type aglycone 或protopanaxatriol-type aglycone 之產製。事實上，本製程最早期即中醫藥學家所採用之紅參製備方式，經加熱水解所造成之糖基裂解，以增加原本人參中較稀少之Rh1、F1、Rh2、F2 等的含量。中期則以此為基礎尋找較佳之加熱溫度、酸水解或鹼處置等，後有研究者從腸道菌或栽培區土壤菌落中分離酵素如 -glucosidase、-glycosidase、gisenosidase 等或採上述酵素之基因重組提供做為酵素轉化之產製製程，其自 Rb1 至 CK 之轉化率約為 2 – 84%；至今甚多學者則採取發酵製程方式，主要採取之為生物包括腸菌系統（如 Bifidobacterium spp.、Bacteroiddes spp.）、真菌系統（Aspergillus niger）、食品級微生物系統（Aspergillus niger、Bifidobacterium sp. Int57 或 SJ32、Lacbacillus paralimentarius LH4）等，藉此產生F2 或 Compound K 等，其自 Rb1 至 CK 之轉化率約為 15 – 88%。因此，尋找轉化效率較高之酵素或微生物進行 dammarane-type ginsenosides 轉化及量產製程之設計，勢必是未來醫藥生技產業對於人參產品開發之一大趨勢。

 

研究目的

從產業角度而言，人參於全球膳食輔助品、機能性食品甚或保健食品均為重要之植物組成品之一，全球一年人參之產量約為 10000 至 12000 噸，且需求量日趨增加；但由於人參栽種過程十分耗時耗資，從第一年開始育苗，第五年收集果實以保育種子，且因需待人參果實採收後，養份才會進入人參根體部，因此人參根體部需直至第六年以上才能收成。另待人參根體部於第六年採收後，因栽種地土壤經人參根體部多年之吸收後養分會出現貧乏及不均之現象，因此生長地均須採輪耕及休耕之方式施作；且因多年栽種，農家多會施以農藥，因此常會出現農藥及重金屬殘留之問題，這在近期衛福部已大力要求人參及人參茶包需標示農藥及重金屬檢驗合格證明。由此回頭看看傳統中醫藥學家對於人參之採用，初期以根部入藥，後有以根鬚、果實、花或蘆部等部位入藥者；因此傳統中醫藥學家即知以多重之角度來利用人參之整株植株，但本草典籍中亦載明其他部位之藥效均低於人參根部，而參蘆則建議用之以代瓜蒂。即至今日之醫藥生技產業界則著重於人參及其衍生複方之多項製品，如最基本之飲片、膠囊、飲品等，但亦均脫離不了每年全球人參之總產量。雖現在有些學者希望採用組織培養、酵母菌工程或轉殖植物等技術，從生合成源頭，借助外在組織、細胞之運用，來增加 dammarane-typeginsenosides 之提供從而替代原植物供給限制與窘迫之現象，但目前仍面臨著兩大問題：技術尚未純熟且無法轉至量產、生產以 dammarane-type ginsenosides 為主仍須面臨各體腸道菌落差異。然而，在技術研究過程亦有助我們了解植株發育及 dammarane-type ginsenosides 生合成之過程，使我們知道人參枝葉實際亦富含 dammarane-type ginsenosides，其含量約為人參根部之2-3 倍。因此，若以對人參之多重利用角度而言，選人參枝葉為開發題材有下述兩個優點：dammarane-type ginsenosides 含量較高、廢物利用而再次提升人參植株之價值。另一方面，再進一步採用微生物發酵轉化技術，將原本廢棄之材料轉化為較人參 dammarane-type ginsenosides 更高價值而效價之Rh1、F1、Rh2、F2、compound K。

【第一年】

A 篩菌技術與人蔘皂苷分析

實驗所選菌株分別為黑霉菌 Aspergillus niger Tieghem (AN 30891)、Aspergillus niger van Tieghem (AN32073) 、乳酸菌 Lactobacillus paralimentarius Manes-Lazaro et al (BCRC80217) 、乳酸菌 Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii Weiss et al. (BCRC12195) 和益生性乳酸桿菌 (CMU995) 等菌。本試驗以MRS培養基標準配方為例，同時加入不同比例的人蔘莖葉及根部之萃取物。以MRS之基本組成原料作為基礎營養培養基(Basic medium ， BM; BM: 2% glucose ，1% yeast extract， 0.1% Tween 80， 0.2% ammonium citrate， 0.5% sodium acetate， 0.02% MgSO4 ， 0.004% MnSO4 ， 0.04% K2HPO4 )，最後將添加人蔘粉(5%)的培養基滅菌冷卻後，分別加入乳酸菌菌液的菌種，於37℃培養箱中靜置培養。將發酵培養完之菌液以8000 rpm，10min離心取上清液，並加入水飽和正丁醇，水飽和正丁醇與菌液比為5:1，之後以超音波震盪10 min，靜置1小時，取分層之上層，並以真空乾燥將丁醇層乾燥，最後再以純甲醇回溶。人參粉以1 g/10 ml之比例與80%的甲醇混合，並以70℃加熱1小時，過濾，再加入甲醇後加熱，再過濾，收集兩次過濾的濾液，並將濾液中的水分烘乾後加入水飽和正丁醇10ml以超音波震盪10 min，靜置1小時，取分層之上層，以真空乾燥將丁醇層乾燥後再以純甲醇回溶。

B 離體神經保護功效評估

B1 In vitro AchE inhibiting activity assay

取 50 mM 之phosphate buffer（pH = 8.0），加入不同濃度之4~5 個濃度之人參枝葉發酵物溶液，以tacrine 為標準品；加入 10 mM ATCh 為受質，加入 recombinant AchE 或 BuchE，再加入 1 mMDTNB，測定其 6 分鐘在 412 nm 波長下之吸光值變化。 B3 In vitro inhibition of Abeta aggregation 將 2 mM Abeta 1-40 以50 mM phosphate buffer（pH 7.4）稀釋至 10 μM，加入4~5 個濃度之人參枝葉發酵物溶液；置於 37℃ 一週，促進 Abeta aggregation，於每日各取樣 30 μL 的反應液：其中 20 μL 用以進行 Thioflavin T assay。Thioflavin T assay：將 20 μL 反應液注入96-well 螢光盤後，加 180 μL 5 μM Thioflavin T 後，測定其螢光強度（Ex 450 nm、Em 485 nm）

B5 In vitro neuroprotective effects

取密度約八分滿的 SH-SY5Y neuroblastoma cell，進行繼代，將SH-SY5Y cell 轉殖至96-well plate，於37℃、5％ CO2 培養箱中培養。待細胞增殖到適當密度後，更換培養基，加入人參枝葉發酵物溶液，於 30 分鐘後加入Abeta 1-40（20 μM）、6-OHDA（35 μM）、MPTP（1 μM）；處理後24 小時，進行cell viability（MTT assay）。

【第二年】

A 發酵技術與工程

A1 篩選菌種之發酵條件測試

將篩選的潛力菌株以試當的培養基進行活化後，利用以下不同條件測試其酵素活性動力圖及人蔘皂苷轉化圖譜及含量，例如: Rb1, Rg1, Re及F1, Compound K, Rh1, Rh2等醣基皂苷

A2 饋料發酵製程

由前者之實驗結果，確認可促進發酵之重要碳源及氮源後，配製5%高濃度之培養基，設定發酵最適化條件後，以發酵槽進行自動化饋料控制，同時分析乳酸桿菌之生長情形、pH 值、殘醣量及菌數活性變化等數據，最後即可確認饋料之比例配方及流速等最佳化發酵條件，並評估人蔘皂苷之轉化率。

A3 發酵操作

先將100L 發酵槽體清洗乾淨後，關閉所有進氣及液體採樣管路，打開主蒸氣閥使高溫蒸氣通入槽體，待溫度上升至121℃時開始計時1200 秒進行殺菌。接著加入測試之培養基成份，開始進行高溫蒸氣滅菌，溫度上升至121℃時開始計時1800 秒。培養基完成滅菌後以冷卻循環水降溫至37℃左右，倒入1 公升種菌後進行發酵培養18~24 小時，並維持適當之pH 值，發酵期間於0、4、12 及24 小時進行菌液取樣，以評估人蔘皂苷之轉化情況。

B 對擬巴金森氏症動物模式之神經保護作用

B1 MPTP-induced parkinsonism C57BL/6J mice PD model

以 6 週齡雄性 C57BL/6J mice 為實驗動物，連續4 次腹腔注射給予 20 mg/kg MPTP，最後一劑後7 天，進行行為評估，人參枝葉發酵物則在MPTP 給藥前30 分鐘口服給予，並於MPTP 最後一劑給藥後，繼續給藥7 天直至行為評估。

C 對擬阿茲海默氏症動物模式之神經保護作用

C1 Abeta 1-42-induced Alzheimer’s SD rats AD model

以舒泰進行6 週齡雄性SD 大鼠麻醉，麻醉後，置於立體定位儀上，於側腦室 （AP=-0.9、ML=-1.5、DV=-3.2），注入Abeta 1-40（7.5 nmol/5 μl）；最後進行縫合，歸回飼養籠中照顧，於8日後進行行為測定；而化合物則採口服方式於手術當日之手術前及手術後每日給予，直至行為測定結束。

測試物質：人參粉萃取物、發酵品

共分18 組，mice 實驗每組 8 隻，rats 實驗每組 10 隻。

（1） Solvent or Sham 組

（2） Induced 組：MPTP （20 mg/kg/2 hr x 4）、Abeta 1-40（7.5 nmol/5 μl）

（3） 人參粉萃取物（3 doses）組

（4） 人參粉發酵品（3 doses）組

C57BL/6J 品系雄性小鼠、Sprague-Dawley 系雄性大鼠，6 周齡大。購自樂斯科，購入後飼養於中國醫藥大學動物中心，環境維持 23+1 ℃日夜控制於12 小時明暗。於兩週後進行實驗。

D. In vivo behavioral measurement

D1 水迷宮（water maze）－Abeta 1-42-induced Alzheimer’s SD rats AD model

本實驗將泳池分成四個象限，逃逸平台固定置於第四象限上，而大（小）鼠依序分別置入四個象限，每天訓練4 次，每次 2 分鐘；若大（小）鼠於 2 分鐘內即找到逃逸平台，讓大（小）鼠休息 30秒鐘後，抓出泳池休息 30 秒鐘，在進行下一次之訓練；但若大（小）鼠於 2 分鐘尚未找到逃逸平台，則將大（小）鼠抓到逃逸平台，休息 30 秒鐘後，抓出泳池休息 30 秒鐘，在進行下一次之訓練；共訓練3 天。於第4 天將逃逸平台自水面下取走，再將大（小）鼠置於第一象限，連續測定60 秒鐘，記錄大（小）鼠於泳池內游泳之軌跡及於原逃逸平台所花之時間及游泳距離；於第5 天再將逃逸平台置入第四象限並使其露出於水面1 cm，訓練4 次；於第6 天將逃逸平台置於第二象限，加水使其沈入水面1 cm，大（小）鼠先置入第一象限，連續測定120 秒鐘或至大（小）鼠找到逃逸平台；休息 4 小時後，再將大（小）鼠先置入第三象限，亦連續測定120 秒鐘或至大（小）鼠找到逃逸平台。

D2 運動活性測定－MPTP-induced parkinsonism C57BL/6J mice PD model

分成 bar test 及 grid test 兩部分，將兩測試項目所獲數値平均。

A. Bar test：將一根棍子架於桌面上 10 cm 處，並將大（小）鼠之前腳輕輕置於棍子上，使大（小）鼠呈半直立狀態；紀錄大（小）鼠移動足趾之時間（稱為 descent latency），連續測定3 次。

B. Grid test：並將大（小）鼠輕輕置一直立鐵網格板（高 44 cm、寬 25.5 cm、網格 1.3 cm）上，紀錄大（小）鼠移動足趾之時間（稱為 descent latency），連續測定3 次。

 

結果與討論

【第一年】

A 篩菌技術與人蔘皂苷分析

實驗分為人參粉萃取物中的物質確認、對人參粉發酵較優之菌株選擇以及使用較優菌對人參葉之發酵。首先，本實驗將從人參粉萃取物中的成分開始探討，並在處理完的萃取物中加入主要分析物的標準品(Rb2、F2、CK)以確認其在HPLC 圖譜中之波峰位置。

下圖為炳翰公司所產之人參粉及添加入標準品之圖譜，從圖中比較裡可看到在圖中其產品Rb2的成分較其他成分為多；而如CK，F2 其成分近乎為零，此結果與其產品成分標示相符。同時確認出主要分析物的波峰出現時間。並可依此判斷後續菌種發酵實驗產物出現時間及多寡。

而下圖部分則為人參葉之萃取，可看出各成分含量除Rb2皆較少，就此結果推測可能跟人參實根成長周期有關，於人參實根成長期中人參葉各成分含量可達2-3倍同時期的人參實根，而在之後實根成熟期(紅果期)後原先葉部的成分可能會部分轉移到實根[索達華 et al. 1990] 。導致於在成熟期(紅果期)後葉子中所含成分的減少。

分別是BCRC12195、BCRC80217、CMU995 這3 種菌株於37℃、72 小時對炳翰製藥公司所生產的人參粉進行發酵，可由圖中波鋒面積大小判斷出BCRC80217、CMU995 皆優於BCRC12195，其中BCRC80217 對人參粉轉化的效果又優於CMU995，而AN30891 及AN32073 於72 小時後的發酵結果不佳，其轉化成分幾乎沒有生成轉化。基於此結果，後續對人參粉的長時間發酵及人參葉的發酵菌種皆選為BCRC80217。

下二圖分別為BCRC80217 對人參粉及人參葉的發酵，時間分別為48、72、96 小時。於下圖中可看出隨著時間經過CK 的量會越來越多，0.05 mg/ml (24 小時)，0.114 mg/ml (48 小時)，在96 小時會達到最大0.13 mg/ml (轉化率27.9%)，然在72 小時到96 小時其變化差異不多，若需使用在工業生產上，則培養72 小時即可。這一點在未來以生物反應器大量發酵的實驗中會加以觀察確認。

至於下圖人參葉發酵中雖可看到隨著時間經過Rb2 等成分被消耗，但其產物卻是生成不多，推測是人參葉中可能含有某種能抑制菌種轉化的成分，導致其雖有消耗成分卻沒有生成所要之產物，這一點在未來會嘗試直接以人參葉萃取物進行發酵，並觀察萃取物中是否也含有抑制物質。

B1 In vitro AChE inhibiting activity assay

按審查委員之建議，本實驗先進行 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 對 AChE活性抑制作用之評估。其各別ginsenosides 對 AChE 活性之抑制作用，Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh2 於實驗使用濃度 (1 – 25 μM) 對 AChE 活性之抑制作用均未超過百分之五十；Rh1、F2、CK 對 AChE 活性之百分之五十抑制濃度分別為37.65Å}1.70、32.84Å}2.37、19.95Å}0.77 μM，其中以 CK 之作用最佳。最後，進行人參發酵液於離體對 AChE 活性抑制作用之分析，並與人參萃取液比較之；結果如下圖：人參發酵液抑制 AChE 活性百分之五十時所需之濃度為相當於65.95 mg 人參，而人參萃取液抑制AChE 活性百分之五十時所需之濃度為相當於768.72 mg 人參；顯示經過發酵後，可提高十倍以上人參對 AChE 活性之抑制作用。

B3 In vitro inhibition of Abeta aggregation

按審查委員之建議，本實驗先進行 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 與 Abeta1-40 共處理後於 37 ℃培養，結果；Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK 均可抑制 Abeta 1-40 aggregation 之形成，且隨共培養劑量與天數之增加，其抑制作用亦明顯增強。其中 Rb1、Rb2、Re、Rg1 需於 10 – 25 μM 濃度下與Abeta 1-40 共處理培養第十一天後始得抑制 Abeta 1-40 aggregation之形成，而 Rh1、Rh2 則需於 5 – 25 μM 濃度下與Abeta 1-40 共處理培養第七天後始得抑制 Abeta 1-40 aggregation 之形成，至於 F2、CK 則需於 5 – 25 μM 濃度下與Abeta 1-40 共處理培養第七天後始得抑制 Abeta 1-40 aggregation 之形成：總結 ginsenosides 對 Abeta 1-40 aggregation 形成之抑制作用以 Rh1、Rh2、F2、CK 較 Rb1、Rb2、Re、Rg1 為佳，其中又以F2、CK 之效果最佳。最後，進行人參發酵液於離體對 Abeta 1-40 aggregation 形成抑制作用之分析，並與人參萃取液比較之；結果如下圖：人參發酵液 (相當於 5 – 100 mg 人參藥材重/mL) 可抑制 Abeta 1-40 aggregation 之形成，且隨共培養時間及發酵液濃度之增加，其抑制活性亦明顯增加；而人參萃取液 於低濃度 (相當於 5 – 12.5 mg 人參藥材重/mL) 下有促進 Abeta 1-40 aggregation 形成之作用，且於共培養第四天時最為顯著，而於共第七天至第十一天時在高濃度 (相當於 75 – 100 mg 人參藥材重/mL) 下可抑制 Abeta 1-40 aggregation 之形成；顯示經過發酵後，可提高人參對 Abeta 1-40 aggregation 形成之抑制作用。

B5 In vitro neuroprotective effects

按審查委員之建議，本實驗先進行 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 對Abeta 1-40 誘導 SH-SY5Y 細胞之細胞死亡的保護作用。SH-SY5Y細胞以20 μM Abeta 1-40 誘導 24 小時後的細胞存活率為49.85 – 52.81%，當事先給予Rh1、F2 (10 – 100 μM)、Rh2、CK (1 – 10 μM) 時，SH-SY5Y 之細胞存活率會隨著濃度增加而升高，結果Rh2、CK (1 – 10 μM) 對 Abeta 1-40 導致SH-SY5Y 細胞之細胞死亡具有較佳之保護作用。最後，進行人參萃取液與人參發酵液 (10 – 250 μg/mL)對 Abeta 1-40 誘導 SH-SY5Y 細胞之細胞死亡的保護作用；結果如下圖：人參發酵液對 Abeta 1-40 導致SH-SY5Y 細胞之細胞死亡具有較佳之保護作用。

按審查委員之建議，本實驗先進行 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 對6-OHDA 誘導 SH-SY5Y 細胞之細胞死亡的保護作用。SH-SY5Y細胞以35 μM 6-OHDA 誘導 24 小時後的細胞存活率為49.75 – 50.80%，當事先給予Rh1、F2 (10 – 100 μM)、Rh2、CK (1 – 10 μM) 時，SH-SY5Y 之細胞存活率會隨著濃度增加而升高，結果Rh2、CK (1 – 10 μM) 對 6-OHDA 導致SH-SY5Y 細胞之細胞死亡具有較佳之保護作用。最後，進行人參萃取液與人參發酵液 (10 – 250 μg/mL) 對 6-OHDA 誘導 SH-SY5Y 細胞之細胞死亡的保護作用；結果如下圖：人參發酵液對6-OHDA 導致SH-SY5Y 細胞之細胞死亡具有較佳之保護作用。

按審查委員之建議，本實驗先進行 ginsenosides (Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rh1、Rh2、F2、CK) 對MPTP 誘導 SH-SY5Y 細胞之細胞死亡的保護作用。 SH-SY5Y 細胞以1 μM MPTP 誘導 24 小時後的細胞存活率為57.84 – 62.88%，當事先給予Rh1、F2 (10 – 100 μM)、Rh2、CK (1 – 10 μM) 時，SH-SY5Y之細胞存活率會隨著濃度增加而升高，結果Rh2、CK (1 – 10 μM) 對 MPTP 導致SH-SY5Y 細胞之細胞死亡具有較佳之保護作用。最後，進行人參萃取液與人參發酵液 (10 – 250 μg/mL) 對 MPTP 誘導SH-SY5Y 細胞之細胞死亡的保護作用；結果如下圖：人參發酵液對 MPTP 導致SH-SY5Y 細胞之細胞死亡具有較佳之保護作用。

【第二年】

A 發酵技術與工程

如下層析圖，以HPLC 可迅速分析並定量 8 種人參皂苷成分〈Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rh1、Rh2、F2、CK〉，標準品檢量線濃度在 10 – 200 μg/mL，R2 均大於 0.99。發酵液並無相關檢測成分。當加入人參粉或加入最後選用之 3 種菌株〈代號 3、16、60〉時，經發酵 48、96 小時後，其檢測之層析圖如下；從層析圖中可知 3 種菌株〈代號 3、16、60〉均具備轉化之能力且在 48 小時時具有較佳之轉化效果。計算其 8 種人參皂苷成分〈Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rh1、Rh2、F2、CK〉之含量，其變化趨勢如圖；三種菌株〈代號 3、16、60〉均可轉化 Rb1 為其他類型之人參皂苷成分，但僅第一種菌株〈代號 3〉可轉化 Re。至於，轉化後第一種菌株〈代號 3〉可增加較多之 Rh1、Rh2、F2、CK；但第二及第三菌株〈代號 16、60〉會有較多之 Rg 及 Re。因此，選用第一菌株〈代號 3〉作為發酵之菌株，而發酵之時間則採用 48 小時，因發酵 96 小時後各類人參皂苷成分均會減少。